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熒光定量PCRZ常用的方法

  • 發(fā)布日期:2016-09-22      瀏覽次數(shù):1786
    •      熒光定量PCR檢測zui常用的方法:
          理論上PCR是一個指數(shù)增長的過程,但是實際的PCR擴增曲線并不是標準的指數(shù)曲線,而是S形曲線。
          這是因為隨著PCR循環(huán)的增多,擴增規(guī)模迅速增大,Taq酶、dNTP、引物,甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求,PCR的效率越來越低,產物增長的速度就逐漸減緩。當所有的Taq酶都被飽和以后,PCR就進入了平臺期。由于各種環(huán)境因素的復雜相互作用,不同的PCR反應體系進入平臺期的時機和平臺期的高低都有很大變化,難以控制。所以,即使是96次PCR重復實驗,各種條件基本一致,所得結果有很大差異,所以在實驗過程中我們不能根據(jù)zui終PCR產物的量直接計算出起始DNA拷貝數(shù)。
          熒光定量PCR檢測的方法:
          熒光定量PCR檢測所使用的熒光化學可分為兩種:熒光探針和熒光染料。而熒光定量 PCR 的方法相應的可分為特異類和非特異類兩類,特異性檢測方法是在PCR反應中利用標記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產物;而非特異性檢測方法是在在PCR反應體系中,加入過量熒光染料,熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后,發(fā)射出熒光信號。前者由于增加了探針的識別步驟,特異性更高,但后者則簡便易行。
          熒光定量PCRzui常用的方法是DNA結合染料SYBR GreenⅠ的非特異性方法和Taqman水解探針的特異性方法,在這里主要介紹這2種方法,其它方法請參考其它熒光定量PCR資料。
          1、非特異性SYBR Green I染料法
          SYBR Green I是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料(結合示意圖),在游離狀態(tài)下,SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光,但一旦與雙鏈DNA結合后,熒光大大增強(作用機理圖)。因此,SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數(shù)量相關,可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。
          2、特異性Taqman水解探針法
          Taqman熒光定量技術是以Taqman熒光探針為基礎,Taqman熒光探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個熒光發(fā)射基團和一個熒光淬滅基團。探針完整時,發(fā)射基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;
          PCR擴增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使熒光發(fā)射基團和熒光淬滅基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。從而實現(xiàn)定量(如下圖)。常用的熒光基團是FAM, TET, VIC, HEX。