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用于生物顯微鏡觀察的標(biāo)本應(yīng)該具備什么樣的條件

  • 發(fā)布日期:2019-01-27      瀏覽次數(shù):1712
    •   用于生物顯微鏡觀察的標(biāo)本應(yīng)該具備什么樣的條件
        用于生物顯微鏡觀察的標(biāo)本必經(jīng)經(jīng)過(guò)一定的準(zhǔn)備過(guò)程才能在顯微鏡下形成清晰的像i在入射照明和透射照明中,對(duì)于標(biāo)本的光學(xué)要求有很大區(qū)別,在入射照明中傷是由標(biāo)本的反射光所形成的;相反,在進(jìn)射照明中保是由透射光所形成的,在這種情況下反射光對(duì)于像的形成不僅無(wú)益,而且會(huì)降低像的清晰度。
        用入射光觀察的標(biāo)本,它的準(zhǔn)備工作十分簡(jiǎn)單,只是清潔標(biāo)本的表面并切割為適當(dāng)大小的小塊。而用透射光觀察的標(biāo)本,必須具有由于光吸收的差異而產(chǎn)生的一定反差,才能在顯微鏡下披觀察到。為此,標(biāo)本必須經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的處理和制備過(guò)程,這種制備技術(shù)就是我們一般所說(shuō)的生物顯微鏡技術(shù)。
        從光學(xué)觀點(diǎn)出發(fā),對(duì)于用透射光觀察的顯微鏡標(biāo)本有如下要求:
        (1)適當(dāng)?shù)暮穸?。這種厚度在較好的光學(xué)系統(tǒng)中能夠達(dá)到盡可能高的分辨力,且與這個(gè)系統(tǒng)的場(chǎng)探相適應(yīng)。
        (2)足夠的透明度。
        (3)能夠形成建立在吸收差異上的足夠的反差。
        實(shí)際上所有的生物學(xué)材料通過(guò)石措包埋、切片(或涂片)、貼附、溶蠟、透明等過(guò)程,能夠得到在厚度和透明度上符各要求的標(biāo)本,然后通過(guò)染色程序得到一定程度的反差。
        通常在透射式生物顯微鏡中所使用的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)組織切片,它的厚度一般為3—7μm。在這個(gè)厚度范圍內(nèi),當(dāng)使用低倍物鏡(例如10×)觀察時(shí),場(chǎng)深對(duì)于觀察整個(gè)切片厚度是*足夠的;當(dāng)使用高信物鏡(例如100×)觀察時(shí),場(chǎng)深僅僅是這個(gè)切片厚度的很小部分(圖4.8),不斷地從上到下移動(dòng)細(xì)調(diào)可以得到切片的總體印象。因此,5—7μm厚的常規(guī)切片可以被認(rèn)為是在低放大倍數(shù)和高放大倍數(shù)理想情況之間的調(diào)和,兩者都較好地考慮到了場(chǎng)深和分辨力。同時(shí)由于種種原因,這種調(diào)和的厚度也滿足了實(shí)際工作中的許多要求,首先物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)不總是直要的;其次在很薄(1—2μm)的切片中生物標(biāo)本中的立體關(guān)系就看不到了;與此相反,當(dāng)使用8—10μm或者更厚的切片時(shí),除了分辨力上可覺(jué)察的損失而外,還會(huì)引起生物標(biāo)本中不同層次的互相重疊。
        經(jīng)過(guò)固定、包埋、切片、溶蠟、透明等處理之后的動(dòng)植物材料標(biāo)本是足夠薄和透明的了,但是反差很小,并且這種反差主要來(lái)自于折射和衍射。顯然,這種標(biāo)本在反差上是遠(yuǎn)不理想的。但是這可以通過(guò)降低折射效果給它覆蓋上“吸收物質(zhì)”,并通過(guò)吸收的差異而增大反差。在標(biāo)本與周圍區(qū)域之間的折射,可以通過(guò)把標(biāo)本封藏在加拿大樹(shù)被或其他人工合成的封藏介質(zhì)中的方法而減小。所有這些封藏介質(zhì)經(jīng)過(guò)揮發(fā)或聚合使其變硬之后,它們的折射率就接近被固定或被脫水的動(dòng)植物組織主要成分的折射率。在大多數(shù)動(dòng)植物組織中這個(gè)數(shù)值為1.5l一1.54。同時(shí)用這個(gè)方法還可以消除蓋玻片下面的反射引起的閃光。
        已經(jīng)應(yīng)用了一個(gè)多世紀(jì),并且能夠給生物顯微鏡標(biāo)本帶來(lái)較好反差的有效方法是染色。一般沒(méi)有染色的生物標(biāo)本,特別是當(dāng)放置在具有與生物標(biāo)本相近折射率的介質(zhì)中時(shí),像的反差是很小的。在染色的標(biāo)本中,像的反差的增大是建立在染料選擇性分布的基礎(chǔ)上。染色與未染色標(biāo)本在反差上有巨大差異。
        生物切片經(jīng)常粘貼在具有26×76mm標(biāo)準(zhǔn)尺寸和1.1—1.3mm厚度的裁玻片上,裁成片的兩面應(yīng)是平行平面。對(duì)于裁濃件厚度的要求不是很嚴(yán)格的,但是當(dāng)它的厚度超過(guò)一些較高矯正程度集光器的自由工作距離時(shí),裁玻片厚度對(duì)于聚焦光源以及在物體平面上形成祝場(chǎng)光闌的像就變得重要了。對(duì)于這種情況,厚度為0.9—1.0mm的裁玻片是比較合適的。