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簡述腺病毒包裝

  • 發(fā)布日期:2013-11-20      瀏覽次數(shù):4897
    • 腺病毒概述

          腺病毒(Adenovirus,AdV)是一種無包膜的線性雙鏈DNA病毒,基因組長約35000 bp,理論上可編碼22~40個基因,兩端各有長約100~150bp的末端反向重復(fù)序列(ITR),在其左端ITR3,端為長約300bp的包裝信號(Ψ)。病毒顆粒直徑約80~110 nm,病毒衣殼有252個殼粒,呈規(guī)則的正二十面體面體結(jié)構(gòu),其中包括240個六聯(lián)體和12個位于正二十面體頂部的五聯(lián)體構(gòu)成。

          腺病毒是一種非整合型雙鏈DNA病毒,在自然界中廣泛分布。盡管一些類型的腺病毒會引起人胃腸道、呼吸系統(tǒng)或眼部的急性感染,但是應(yīng)用于基因治療研究的腺病毒是安全的,對人無致病、致畸、致癌的潛在危害。

          利用基因工程手段將腺病毒基因組DNA改造成多種基因操作表達(dá)載體,目前常用的腺病毒包裝系統(tǒng)有:AdMax系統(tǒng)和AdEasyTM系統(tǒng)。

       

      AdEasyTM包裝系統(tǒng) 

          AdEasyTM 包裝系統(tǒng)主要的特點是利用Cre/loxP系統(tǒng)在大腸桿菌(BJ5183)中完成外源基因插入腺病毒基因組的過程,獲得環(huán)狀的重組腺病毒基因組,并且具有在細(xì)菌中復(fù)制的必需元件。將重組腺病毒基因組酶切線性化后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,避免了雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染得到重組腺病毒。

      使用這個系統(tǒng)需要注意以下問題: 

      (1) 要用能表達(dá)Cre重組酶的特定的大腸桿菌,建議建立菌種庫以免細(xì)菌發(fā)生變化;

      (2) 由于重組是在細(xì)菌中發(fā)生的,微小的基因組變化不易發(fā)現(xiàn); 

      (3) 要獲得高品質(zhì)的重組腺病毒毒種(高病毒產(chǎn)量、高目的基因表達(dá))應(yīng)挑選多個重組腺病毒質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,獲得多個重組病毒來篩選。

       

      AdMax包裝系統(tǒng) 

          AdMax包裝系統(tǒng)是通過Cre/loxP 獲得重組病毒,這個過程發(fā)生在HEK293細(xì)胞中,從而避免在細(xì)菌中重組。將克隆了外源基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒與攜帶了腺病毒大部分基因組的包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,利用Cre/loxP系統(tǒng)的作用實現(xiàn)重組,產(chǎn)生重組腺病毒。這個系統(tǒng)有多種優(yōu)勢,包括操作簡便、重組效率高、獲得的病毒產(chǎn)率高、目的基因的表達(dá)水平高(因為mCMV啟動子比hCMV啟動子強若干倍)等。 

          與AdEasy系統(tǒng)相比,AdMax系統(tǒng)有一定的優(yōu)勢:只需要3~4周就能完成從質(zhì)粒構(gòu)建到重組出毒,成功率大于98%(其中95%的克隆含有目的基因),因在真核細(xì)胞內(nèi)重組出毒,保持了對腺病毒的生存壓力,有助于重組腺病毒的基因組的完整性;而AdEasy系統(tǒng)的出毒成功率只有18~34%(Stratagene公司新版的AdEasy XL系統(tǒng)成功率在94%左右),且在細(xì)菌(BJ5183)中完成病毒基因組重組,理論上,失去了生存壓力的腺病毒基因組更容易發(fā)生突變,病毒遺傳背景及活性可能會受到影響。

       

      腺病毒載體有下列優(yōu)點:

      1、腺病毒的基因結(jié)構(gòu)與功能研究的比較清楚;

      2、可裝入基因的容量較大(8K);

      3、轉(zhuǎn)染范圍廣,轉(zhuǎn)染率較高,所有腺病毒載體均有轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細(xì)胞的能力;

      4、不整合到靶細(xì)胞基因組,無插入突變,無致癌性,對人無致病、致畸、致癌的潛在危害;

      5、可以復(fù)制出滴度高(可以達(dá)到1011 pfu/mL)、穩(wěn)定性好、基因轉(zhuǎn)移效率高的病毒;

      6、適用于在難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中進(jìn)行的RNA干擾、過表達(dá)特定基因或過表達(dá)特定microRNA研究和In Vivo實驗。 

       

      腺病毒包裝

          重組腺病毒包裝是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA為架,在克隆,包裝,擴增等各部條件做了改進(jìn)和優(yōu)化,達(dá)到了克隆陽性率更高,質(zhì)量更可靠,包裝穩(wěn)定,出毒迅速,滴度高等效果。在此基礎(chǔ)上,還拓展了更廣泛的應(yīng)用,可以提供各種帶報告基因的,帶不同標(biāo)簽的腺病毒構(gòu)建和包裝服務(wù)。 

          所包裝的腺病毒已成功應(yīng)用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo),基因轉(zhuǎn)位,Co-IP,干細(xì)胞研究等科研實驗。并且可以完成較高難度的克隆構(gòu)建,包括具有細(xì)胞毒性作用基因的腺病毒構(gòu)建,在短時間內(nèi)完成從原始質(zhì)粒到病毒DNA的構(gòu)建工作。

      服務(wù)簡介:

      提供各種RNA干擾和基因過表達(dá)的腺病毒包裝服務(wù)。

      服務(wù)內(nèi)容:

          是以帶熒光或不帶熒光的pEC3.1(+)為穿梭載體,pAd/BL-Dest為骨架載體進(jìn)行的過表達(dá)病毒包裝;以pGensil為穿梭載體,pAd/BL-Dest為骨架載體進(jìn)行干擾病毒的包裝。