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第七章 封閉(Blocking)

  • 發(fā)布日期:2015-07-14      瀏覽次數(shù):2474
    •    第七章 封閉(Blocking)

         雜交膜上有很多非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合位點,為防止這些位點與抗體結(jié)合引起非特異的染色和背景,一般用惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑封閉膜上的未結(jié)合位點來降低抗體的非特異性結(jié)合。封閉劑應(yīng)該封閉所有未結(jié)合位點而不替換膜上的靶蛋白、不結(jié)合靶蛋白的表位,也不與抗體或檢測試劑有交叉反應(yīng)。zui常見的封閉劑是 BSA、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠和 Tween-200.05 - 0.1%)稀溶液 PBST 或者 TBST

      5%脫脂奶粉或 BSA(室溫孵育 1 h

      Western Blot 膜封閉液

      Tween-20 的作用:Tween-20 是一種非離子型去污劑,有復(fù)性抗原的作用,可提高特異性的識別能力。在做 westen blot 時,用惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑封閉膜上的未結(jié)合位點可以降低抗體的非特異性結(jié)合。Tween 這種非離子型去污劑在乳化蛋白時,不破壞蛋白的結(jié)構(gòu),可減少對蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞。離子型去污劑如 SDS 則破壞蛋白的結(jié)構(gòu)。

      封閉劑選擇的特殊情況:

      脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標(biāo)記的抗體一起使用,因為脫脂奶粉含有糖蛋白和生物素。如果封閉劑中含磷酸酶,用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響,因為磷酸酶與印記膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化。檢測磷酸化抗體時,不能使用酪蛋白/脫脂奶粉作為封閉劑。

      一般封閉條件為:

          室溫或者 37℃緩慢搖蕩 12 h,特殊情況也可 4℃封閉一夜。根據(jù)結(jié)果情況調(diào)整封閉試劑的濃度和類型。比如有時 BSA 比脫脂奶粉更有利于降低非特異性背景,而有些抗體則在脫脂奶粉封閉的情況下才能得到清晰的背景。