目的基因亞克隆

亞克隆

已經(jīng)獲得的目的DNA條帶進(jìn)行重新克隆，其目的在于對(duì)目的DNA進(jìn)行進(jìn)一步分析，或者進(jìn)行重組改造等。

亞克隆的基本過(guò)程包括：

（1）目的DNA條帶和載體的制備；（2）目的DNA條帶和載體的連接；（3）連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；（4）重組子篩選。

目的DNA條帶和載體的制備
    選擇適宜的限制性核酸內(nèi)切酶，消化已知目的DNA和載體，獲得線性DNA，用于重組。根據(jù)目的DNA和載體的具體情況，選擇一種或者兩種適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈睿謩e產(chǎn)生對(duì)稱(chēng)性粘性末端（用一種限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行消化而產(chǎn)生帶有互補(bǔ)突出端）、不對(duì)稱(chēng)粘性末端（用兩種不同的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行消化而產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)突出端）、平端。在亞克隆時(shí)，*不對(duì)稱(chēng)相容末端連接，次選對(duì)稱(chēng)性粘性相容性末端連接，由于平末端連接效率較低，通常很少采用。但有時(shí)目的片段的末端與載體不匹配 ，一般先將不匹配末端補(bǔ)平，然后再以平末端連接。

利用T4 DNA連接酶進(jìn)行目的DNA條帶和載體的體外連接

連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
⑴ 取100μl貯存于-70℃鈣化菌，冰浴化開(kāi)；
⑵ 加入適量連接產(chǎn)物（一般不超過(guò)10μl，輕輕混勻，冰浴20min；
⑶ 于42℃熱休克90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，繼續(xù)冰浴2-3min；
⑷ 加入LB液體培養(yǎng)基200μl，于37℃緩搖孵育45min；
⑸ 將培養(yǎng)物適量涂于1.5%瓊脂LB平板（根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待膠表面沒(méi)有液體流動(dòng)時(shí)，37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr。

重組子的篩選
   根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補(bǔ)、抗生素基因等。現(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒(méi)有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱(chēng)為α-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ 細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無(wú)α-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱(chēng)為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。