上海熒光定量PCR檢測

上海熒光定量PCR檢測的方法：

　　熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料。而熒光定量 PCR 的方法相應的可分為特異類和非特異類兩類，特異性檢測方法是在PCR反應中利用標記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產(chǎn)物；而非特異性檢測方法是在在PCR反應體系中，加入過量熒光染料，熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射出熒光信號。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。

上海熒光定量PCR檢測zui常用的方法是DNA結合染料SYBR GreenⅠ的非特異性方法和Taqman水解探針的特異性方法，在這里主要介紹這2種方法，其它方法請參考其它熒光定量PCR資料。

　　1、非特異性SYBR Green I染料法

　　SYBR Green I是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料（結合示意圖），在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強（作用機理圖）。因此，SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數(shù)量相關，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。

　　2、特異性Taqman水解探針法

　　Taqman熒光定量技術是以Taqman熒光探針為基礎，Taqman熒光探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光發(fā)射基團和一個熒光淬滅基團。探針完整時，發(fā)射基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；

PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團和熒光淬滅基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。從而實現(xiàn)定量（如下圖）。常用的熒光基團是FAM, TET, VIC, HEX。